beat365正版唯一官网颜晓梅教授课题组在细胞外囊泡DNA研究方面取得重要进展，相关成果以“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”为题近日在线发表于Journal of Extracellular Vesicles（J. Extracell. Vesicles, 2022, e12206）。
细胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs) 是细胞分泌的纳米尺度的囊泡，通过将蛋白质、核酸和脂质从供体细胞转移到受体细胞来介导细胞间通讯。最近的研究表明，EVs中存在基因组 DNA、线粒体 DNA 甚至病毒 DNA。通过 DNA 的包装和水平转移，EVs在维持细胞稳态、调节免疫反应和调节肿瘤进展方面发挥着至关重要的作用。最近，已开发出基于EVs中的DNA (EV-DNA) 的肿瘤液体活检测试。尽管已经认识到 EV-DNA 的生物学意义，但对 EV-DNA 的探索较少，许多基本特征仍存在争议，例如：是否每个EVs都携载DNA？EV-DNA主要位于EVs的内腔和/或EVs表面？EV-DNA含量与EVs的粒径有何关系？EV-DNA是以单链还是双链的形式存在？由于 EVs 的大小和内容物含量差异很大，因此迫切需要单粒子技术来破译 EV-DNA 的高度个体异质性，并将 EV-DNA 与游离 DNA 或其他污染物区分开来。然而，EVs的纳米级粒径（大多数大小 <100 nm）和 EV-DNA 的低含量使其成为一个巨大的挑战。
针对这一难题，颜晓梅教授课题组利用实验室自行研制的纳米流式检测仪（nFCM）可检测到直径小至40 nm的单个EVs的散射信号和SYTO 16染色后单个200 bp DNA片段的荧光信号的超高灵敏性能，结合酶处理策略，在单颗粒水平对EV-DNA进行探究。该研究揭示：(1) 从细胞上清中经超速离心制备的EV样本中存在大量游离的DNA或者不依附于EVs的DNA；(2) 单个 EVs中EV-DNA的含量表现出很大的异质性，根据细胞类型的不同，DNA阳性EVs（DNA+ EVs）的比率占总EVs的30%-80%；(3) 黏附于EVs表面的DNA主要定位在粒径相对较小的EVs上（例如HCT-15细胞系，<100 nm），并且抑制外泌体的分泌途径可显著降低这部分EVs的比率；(4) 包裹于内腔的EV-DNA主要封装在粒径相对较大的EVs中（例如HCT-15细胞系，80-200nm）；(5) 双链DNA（dsDNA）是黏附于表面和包裹于内腔EV-DNA的主要存在形式；(6) EVs中未检测到组蛋白，EV-DNA与组蛋白并无关联；(7) 基因毒性药物诱导DNA+ EVs的分泌增多，外部黏附DNA的EVs和内部包裹DNA的EVs数量以及单个EVs中的DNA含量均显著增加。这项研究为深入了解DNA与EVs的关联提供了直接和确凿的实验证据。此外，该研究还首次发现尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）不能有效地将游离DNA从EVs中分离出来，而密度梯度超速离心使得黏附于EVs外部的DNA几乎完全脱落。这些实验结果提醒科研人员在采用凝胶/芯片电泳、PCR或DNA测序对EV-DNA进行表征之前，必须确保EV-DNA的纯度，因为这些集权平均技术无法区分游离的DNA和EV-DNA。
该论文的第一作者为beat365正版唯一官网2017级博士生刘海生。研究工作得到国家自然科学基金委项目(21934004、21627811和21521004)和博士后科学基金（2019TQ0176）的资助。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
